更新時間：2025-06-16 
瀏覽次數：1102S-腺苷甲硫氨酸(SAM)競爭法ELISA試劑盒技術解析與應用
實驗原理
本試劑盒采用競爭法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。在預包被抗S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗體（固相抗體）的微孔酶標板中，加入S-腺苷甲硫氨酸（SAM）校準品和待測樣本，再加入HRP標記的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗原（酶標抗原），經過溫育與充分洗滌，去除未結合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產生藍色產物，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉化為黃色，在酶標儀450nm波長上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的濃度負相關。擬合校準品曲線，可以計算出樣本中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的濃度。
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是生物體內重要的甲基供體，參與多種生化反應。本文詳細介紹了SAM競爭法ELISA試劑盒的工作原理、實驗流程、技術特點及應用領域，為研究人員提供全面的技術參考。
S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為生物體內關鍵的甲基供體，在DNA甲基化、神經遞質合成、磷脂代謝等過程中發(fā)揮重要作用。準確測定SAM水平對于研究甲基化代謝、肝臟疾病、神經系統疾病等具有重要意義。競爭法ELISA以其高特異性、高靈敏度和操作簡便等優(yōu)勢，成為檢測SAM的重要工具。
競爭法ELISA基于以下原理：
微孔板預先包被SAM類似物或結合蛋白
樣品中的SAM與酶標記的SAM競爭結合有限數量的抗體結合位點
樣品中SAM濃度越高，與抗體結合的酶標SAM越少
加入底物顯色后，通過測定吸光度值，其強度與樣品中SAM濃度呈反比
反應公式可表示為：
[Ab] + [SAM*] + [SAM] ? [Ab-SAM*] + [Ab-SAM]
其中Ab為抗體，SAM*為酶標SAM，SAM為待測樣品中的SAM試劑盒組分與保存
未開封的試劑盒保存在2-8度，不得使用過期試劑盒。
組分 | 數量 | 主要成分 | 開封后儲存 |
校準品 | 0.3ml/管 | -- | 2-8℃14天 |
包被微孔板 | 96T/48T | 預包被固相抗體 | 2-8℃14天 |
HRP標記抗原 | 10mL | HRP標記的檢測抗原 | 2-8℃180天 |
底物液A | 6mL | 0.01%過氧化氫 | 2-8℃180天 |
底物液B | 6mL | 0.1%TMB | 2-8℃180天 |
終止液 | 6mL | 2mol/L稀硫酸 | 2-8℃180天 |
樣本稀釋液 | 6mL | PBS | 2-8℃180天 |
20×濃縮洗滌液 | 25mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
說明書 | 1份 | -- | -- |
自封袋 | 1個 | -- | -- |
不干膠 | 2片 | -- | -- |
標準品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 ng/mL.
其他用品
1、 酶標儀（450nm）
2、 精密移液器及一次性吸頭
3、 蒸餾水
4、 洗瓶或者自動洗板機
5、 37℃水浴鍋或恒溫箱
6、 500ml量筒
樣品的采集和儲存
以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。
1、 細胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復凍融。
2、 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在-20℃以下，避免反復凍融。
3、 血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復凍融。
樣本收集后，無法一次檢測完畢，請按一次用量分裝凍存，避免反復凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。
4、 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘，取上清檢測。
5、 細胞提取液：貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過反復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
試劑準備
1、 使用前，所有的組分都要至少復溫60min，確保充分復溫到室溫。
2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結晶產生，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。
3、 底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內使用。
操作程序
所有試劑和組分都先恢復到室溫，標準品、質控品和樣品，建議做復孔。
1、 按前面說明書描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。
2、 從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。
設置標準品孔、空白孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL，空白孔不加，樣本孔加待測樣本50μL。
3、除空白孔外，標準品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗原100μL。
4、 用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5、 揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20S，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復5次。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應板。
6、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。
7、 所有孔加入終止液50μL，在酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值）。
結果計算
1、 以標準品濃度做為橫坐標，對應的吸光度（OD值）作為縱坐標，利用計算機軟件，采用四參數Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
2、 如果樣品被稀釋，通過上述方法測的濃度值，要乘以稀釋倍數，才是樣品的最終濃度。
試劑盒性能指標
1、物理性能
試劑盒的各液體組分應澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝，無破損漏氣。
2、劑量反應曲線線性
校準品劑量反應曲線相關系數r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。
4、靈敏度
檢出劑量小于0.1 ng/mL。
5、回收率
三組已知的高、中、低濃度樣品，進行五次在同一個板塊內回收率評估，回收率在85%-115%之間。
6、特異性
本試劑盒識別天然和重組S-腺苷甲硫氨酸（SAM），與結構類似物無交叉。
7、穩(wěn)定性
2℃-8℃保存，有效期6個月。
8、 檢測范圍
3.75 ng/mL - 120 ng/mL
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